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Cromatografia de Interação Hidrofóbica

Já ouviu falar em HIC?

Princípio da HIC

A Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) separa as proteínas, peptídeos e outras biomoléculas com base em seu grau relativo de hidrofobicidade.

< Hidrofobicidade = Alta repelência a água >

No entanto, ao contrário da cromatografia de fase reversa, a cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) é uma técnica não desnaturante, que mantém a atividade biológica. Dessa forma, espera-se que a forma nativa das proteínas seja mantida, o que é importante caso se queira estudar mais características biológicas das proteínas separadas

O princípio da adsorção de proteínas ao meio HIC é complementar à cromatografia de troca iônica e exclusão de tamanho.

Mecanismo de Retenção

Neste processo, as proteínas que passam pela coluna e que possuem cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos em suas superfícies são capazes de interagir e se ligar aos grupos hidrofóbicos da coluna. Em seguida, moléculas de amostra contendo regiões hidrofóbicas e hidrofílicas são aplicadas a uma coluna HIC em um tampão de alto teor de sal.

< Hidrofílicas = Possuem afinidade com a água >

Assim, em uma separação HIC, os ligantes hidrofóbicos na fase estacionária interagem com as regiões hidrofóbicas na superfície da proteína e o equilíbrio de adsorção-dessorção na presença de sais determina o mecanismo de retenção

Influência do Sal na Separação

O sal no tampão reduz a solvatação dos solutos da amostra. Como resultado, a diminuição da solvatação expõe as regiões hidrofóbicas, e o meio as adsorve. Quanto mais hidrofóbica a molécula, menos sal a ligação exige. Para ilustrar, a seguinte lista de sais aumenta as interações hidrofóbicas, em ordem crescente de eficácia: Na2SO4 – K2SO4 – (NH4) 2SO4 – NaCl – NH4Cl – NaBr – NaSCN

Eluição na HIC

Normalmente, utiliza-se um gradiente decrescente de sal para eluir amostras da coluna a fim de aumentar a hidrofobicidade. Em contrapartida, na prática, as proteínas ligam-se à fase estacionária de HIC na presença de alta concentração de sal e eluem-se na ordem de aumento da hidrofobicidade, diminuindo a concentração de sal. Além disso, modificadores orgânicos suaves ou solução tampão de eluição também auxiliam a eluição da amostra. Lembrando que, neste caso, a temperatura e o pH ajudam na resolução dos resultados obtidos. Por fim, a HIC tem utilizado cada vez mais em separações de proteína e proteína conjugada!

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